NGS引物

繼qPCR技術成為分子診斷的主流技術平臺後，第二代測序（NGS）技術的迅速發展給予了科學研究和醫學診斷領域更高的技術平臺及更廣闊的發揮空間。作為NGS應用的重要原料組成，NGS引物和常規PCR引物相比，對於純度、定量精確度、堿基序列準確性及交叉汙染率提出了更高的要求。生工生物擁有二十多年引物合成經驗，我們針對NGS應用優化產品性能和質量，並提供全面的質量檢測。我們同樣擁有先進的NGS技術平臺，能對NGS引物的交叉汙染率進行檢測。

NGS實驗流程包含樣品製備（核酸抽提/核酸製備）、文庫構建、上機測序和生物信息學分析幾個步驟。NGS相關引物主要體現在文庫構建的步驟中。其中，全基因組測序僅需要進行片段化和加接頭的文庫構建步驟，而全外顯子組測序和目標區域捕獲測序除了文庫構建的步驟還需要目標區域捕獲的步驟。

我們的優勢

 1.優選合成原料，優化生產流程，確保極低的堿基錯誤率；
 2.NGS接頭引物交叉汙染率≤0.05%
 3.關鍵質量指標動態批次間差異控製；
 4.建立周期性質量跟蹤體系並定期出具質量跟蹤報告。

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文庫構建

接頭的本質是一段短的堿基序列，基本包括三個部分：與flow-cell上面寡核苷酸相同或互補的片段P5/P7；測序時測序引物結合部分R1/R2；用於區分不同樣本的Index。接頭是待測DNA片段與Flow-cell連接的橋梁，目的片段連接接頭後可以在flow cell上擴增再測序。生工生物可以按您的要求定製各種不同類型的接頭引物，並可提供獨立單鏈、雙鏈混合和雙鏈退火三種不同形式分裝的接頭引物。

目標區域捕獲

雜交捕獲探針根據DNA堿基互補原理，設計與目標捕獲區互補的DNA捕獲探針（帶biotin修飾）。在實驗過程中，先將待捕獲的基因組DNA構建標準NGS文庫，進一步使用捕獲探針與NGS文庫雜交，然後使用鏈黴素磁珠富集雜交後的DNA文庫，洗脫探針後進一步PCR文庫即可NGS測序。生工生物可提供常規合成引物池探針（≤10,000條）和芯片合成引物池探針（≥2,000條）。

備註：

 

*由於芯片合成每條Oligo均在獨立的微反應器中合成，所以本身就是一種物理分隔，加上合成的準確度很高，QC也會對純度進行檢測，故無需額外純化。

通過多重PCR的方法來進行目標區域捕獲適合大規模的樣本和小片段/少位點的富集。和雜交探針捕獲的方法比，常規情況下，多重PCR的費用也更加經濟。

NGS Blocker引物通常用於捕獲建庫過程中阻止文庫接頭的雜交，提高捕獲測序的特異性。生工生物提供定製Blocker引物，並可出具包含純度、分子量等信息的檢測報告。

質量控製

質譜檢測（MS）：確保極低的堿基錯誤率

                                        

 

分子量質譜檢測實例

 

 

測試引物理論分子量為8052.67。通過質譜檢測，實測分子量為8052.5，分子量誤差經計算為-0.002%，

小於質控標準±0.05%。測試引物質譜檢測合格，堿基序列的正確性在質量可控製範圍之內。

質譜檢測（MS）：確保極低的堿基錯誤率

交叉汙染率（CCR）：NGS接頭引物使用 HPLC_CE(IVD) 作為純化方式，交叉汙染率<0.05%，使用HPLC作為純化方式，交叉汙染率<0.1%

   

                                        

 

2019年Q1~2020年Q2季度NGS接頭引物交叉汙染率抽樣檢測

 

 

檢測高通量接頭/引物合成製備過程中的交叉汙染，將index引物建好文庫，進行高通量測序，

計算不同組合的序列頻數。根據頻數計算每一條index引物的交叉汙染概率