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一文 - 教你搞懂化学发光原理、分类、检测项目临床意义

 

 

    化学发光免疫分析方法 (chemiluminescence immunoassay ,CLlA) 创建于1977 年,由 Halmann 等人在RIA和EIA理论的基本上,将免疫反应的高特异性与化学发光的高灵敏性结合起来,建立的一种用于检测微量抗原、抗体、激素、酶等的新型免疫学分析方法。今天我们从专业的角度就化学发光的方方面面进行分享。

 

 

 

 

 

 

 
 
 
 
 

化学发光的前世今生

 
 
 
60年代,使用的是放射免疫检测,优点:成本低、灵敏度高,但缺点很明显,存在放射性污染、有效期短、操作复杂。
 
70年代,出现胶体金技术,虽然操作简单快速,然而,灵敏度低这一问题,始终无法解决,这也是技术本身决定的
 
80年代,出现了酶联免疫法和时间分辨法,比如以上海科华为代表的。国产企业研发的,酶联免疫技术检测产品,成本低且性质稳定,这也是为什么到目前为止,该方法学一直沿用至今,而其灵敏度和精确度问题,也决定了他从此不能担当大任。而时间分辨法虽然一定程度上解决了灵敏度问题,而更多的缺点也暴露出来了,操作复杂,成本高,反应时间长,然而在化学发光还没有问世之前,比如以上海新波为代表的,时间分辨方法学为主的国产企业慢慢发展了起来。如今上海新波也早就被PE完成了战略收购。
 
90年代化学发光开始问世,虽然在国内的推广经历了很长的过程,随着21世纪的到来,在国外技术的影响下,化学发光开始不断发展,尤其是2010年以后,化学发光逐步开始了大面积的,时间分辨方法学替换进程,如今在免疫检测市场,无疑化学发光是独树一帜,引领免疫检测市场,成为免疫诊断主流技术。
 
 
 

化学发光的原理

 
 
 

 

关于化学发光检测原理,化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析,是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析仪器。化学发光免疫分析仪包含两个部分,即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体,回到稳定的基态时,同时发射出光子,我们可以联想一下萤火虫,一闪一闪的,就是生物化学反应后发出的的光信号,而化学发光的原理也是类似的,无非是原理不同,但道理是一样的
 
当光子发出后,化学发光免疫分析仪器中核心探测器件也就是光电倍增管,由单光子检测并传输至放大器,并加高压电流放大,放大器将模拟电流转化为数字电流,数字电流将发光信号由R232数据线传输给电脑并加以计算,得出临床结果。
 
而免疫反应系统是将发光物质直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析)上或酶作用于发光底物。
 
而关于免疫反应体系这里必须讲清楚,抗原抗体反应,这个里面是有未知和已知的关系,如果待测物是测抗原,则抗体是已经知道的,如果待测物是测抗体那抗原是已知的。而前面已经讲了化学发光现象,简单的讲就是光信号的强度和待测物浓度是成一定正比关系的,或者是可以通过,相关关系式换算出来的。
 
 
 

化学发光的分类

 
 
 
技术分类是根据发光体系也就是发光剂的不同进行分类,可分为:间接化学发光、电化学发光、直接化学发光、光激化学发光。今天我们主要讲讲前三类目前主流的发光技术。
 
1、间接化学发光
·他是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体,在与待测标本中相应的抗原(或抗体)发生免疫反应后,形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物,经洗涤后,加入底物(也就是发光剂),酶催化和分解底物发光,由光量子阅读系统接收,光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大,再把它们传送至计算机数据处理系统,计算出测定物的浓度。
优势:发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗,发光信号强而稳定,且发光时间较长;检测方式简单、成本较低。
 
关于间接化学发光,我们要明白以下三点:1、是用酶进行标记抗原或抗体;2、标记复合物反应过程中加入底物也就是发光剂后,经催化和分解产生发光;3、光信号转化为电信号,并由计算机进行处理和换算得到实验结果。代表厂家:贝克曼、迈瑞、西门子、安图等。
 
2、直接化学发光
它是用吖碇酯等直接标记抗体(或抗原),与待测标本中相应的抗原(或抗体)发生免疫反应后,形成固相包被抗体-待测抗原-吖碇酯标记抗体复合物,这时只需加入氧化剂过氧化氢和氢氧化钠形成碱性环境,吖碇酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。
优势:试剂稳定性好,易于保存;标记物为小分子,对标记的抗原/抗体的空间位点几乎不造成影响;本底低,灵敏度好,结果稳定。代表厂家:雅培、新产业、索灵等。
 
关于直接化学发光,我们需要明白以下三点:1、用吖啶酯等标记物标记抗原或抗体;2标记复合物反应过程中加入氧化剂过氧化氢和氢氧化钠形成碱性环境进行分解和发光。;3、光信号转化为电信号,并由计算机进行处理和换算得到实验结果。
 
3、电化学发光
是以电化学发光剂三联砒锭钌标记抗体(或抗原),以三丙胺(TPA)为电子供体,在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应,它包括电化学和化学发光两个过程。

优势:标记物稳定,灵敏度高,可实现多元检测,可控的反应体系快速检测高精密度和高灵敏度宽广的检测范围。由于电化学发光免疫分析具有优越性,是一种很有发展前途的免疫分析法,日益受到人们的重视。

 

关于以罗氏、联众泰克为代表的电化学发光,我们需要明白以下三点:1、用电化学发光剂标记抗原或抗体;2、电化学反应过程中因电子产生转移而出现化学发光;3、光信号转化为电信号,并由计算机进行处理和换算得到实验结果。

以上就是我们化学发光的三种主流化学发光反应方法学介绍

 

 

 
 
 

化学发光检测项目的临床意义

 
 
 

 

                    骨代谢标志物

    项目

           主要临床意义

总Ⅰ型胶原氨基端延长肽(PINP)

用于体外定量检测人体血清或血浆中的总P1NP。该检测适用于绝经后女性骨质疏松症患者和Paget 's骨病患者的疗效评估。

β胶原特殊序列(β-CrossLaps)

用于体外定量检测人体血清或血浆中的I型胶原降解产物。该检测适用于绝经期后妇女和骨量减少个体抗骨重吸收治疗(如二磷酸盐类和激素替代治疗)的疗效评估。

中段骨钙素(N-MID Osteocalcin)

用于体外定量检测人体血清或血浆中的N-MID Osteocalcino该检测 适用于抗骨重吸收治疗(如骨质疏松症和高钙血症)的疗效评。

甲状旁腺素(PTH)

该免疫测定法适用于人血清和血浆中完整的甲状旁腺激素的体外定量 检测,主要用于高钙血症和低钙血症的鉴别诊断。

降钙素(CT)

降钙素是由甲状腺C细胞分泌的多肽类激素,它是维持体内钙磷代谢的重要激素,降钙素通过抑制破骨细胞活性和数量,促进成骨细胞的形成而参与骨代谢。

25-羟基维生素 D 

用于定量测定人血清或血浆中总25羟基维生素D的含量,有助于评估维 生素D缺乏症。

 

                        肿瘤标志物

    项目

             主要临床意义

甲胎蛋白(AFP)

检査AFP对原发性肝细胞癌有重要的辅助诊断作用,但并无特异性其它恶性肿瘤患者血清中AFP也会升高。妊娠期异常升高常提示胎儿有脊柱裂、无脑畸形等。

癌胚抗原(CEA)

CEA测定主要用对结肠癌、直肠癌、胃癌等患者的临床检测 結肠癌、直肠癌患者CEA测定的敏感性高于其它肿瘤标志物.70%-90%的病例CEA会升高。

糖类抗原50(CA-50)

增高常见于各类上皮癌,其中胰腺癌(80%-97%)、胆囊癌阳性率高达94.4%,其它依次为肝癌(80%)、胃肠道癌(77%)。CA50检查结果与CA199很接近。其次非肿瘤性疾病如胰腺炎 、结肠炎、肺炎等,随炎症消除而降。

糖类抗原(CA-125)

卵巢癌时CA125检出率可达70%-90%。适用于浆液性囊腺癌和未分化的卵巢癌。黏液性卵巢癌阳性率较低。检测结果不能用作卵巢癌确诊.也无早期诊断价值,可用于疗效检测和判定有无复发和转移。

糖类抗原(CA-153)

CA153检测可用于乳腺癌患者治疗效果的监测和判定术后有无转移(有转移时CA153升高率可达60%-80%).尤其是骨转移 。不能作为有无恶性肿瘤的绝对评价,也不宜用作乳腺癌的筛査,无早期诊断价值。

糖类抗原(CA-199)

CA199检出率以胰腺癌和胆管癌最髙(达85%-95%),结直肠的腺癌、黏液腺癌患者的CA199水平也较高。

糖类抗原(CA72-4)

升高见于胃癌、卵巢癌、大肠癌、乳腺癌以及胰腺癌等肿瘤,但正常人胃肠道良性疾病也有一定的阳性率,与CA125联合检测对原发性及复发性卵巢癌诊断的特异性高达95%。对胃癌尤其是较为早期或恶性度较高的胃癌诊断阳性率要高于其它血清学指标。

细胞角蛋白19片段(CYFR21-1)

对非小细胞肺癌的诊断具有重要价值,特异性达87%。

人附睾蛋白(HE4)

作为辅助手段用来监控上皮性卵巢癌患者的疾病复发或恶化情况。

总前列腺特异抗原(TPSA)

升高见于前列腺癌、前列腺増生、炎症、肾脏泌尿系统疾病等。

游离前列腺特异抗原(FPSA)

升高见于前列腺癌,FPSA/TPSA比值可帮助鉴别前列腺癌与前列腺增生,前列腺癌患者FPSA/TPSA比值明显低于前列腺增生患者。

磷状细胞癌相关抗原(SCC)

SCC主要用于监测宫颈、肺、食管、肛门、头颈部区域鳞状细胞癌患者的治疗效果和病程。并不是鱗状细胞癌的特异性肿瘤标志物。缺乏临床敏感度和特异性。

神经元特异性烯醇化酶(NSE)

大多数小细胞癌患者血清NSE水平显著升高,且其水平与临床进程相平行。神经母细胞癌患者NSE水平也明显升高。

 

                      甲状腺功能

     项目

            主要临床意义

促甲状腺激素(TSH)

増髙见于原发性甲状腺功能低下,其増加值与甲状腺功能低下的程度成正比。

甲状腺素(T4)

增高见于甲状腺功能亢进症、高TBG(甲状腺结合球蛋白)血症、结节性性甲状腺肿等。减低常见甲状腺功能减退症 、低TBG血症、垂体功能减退症、剧烈活动等。

三碘甲状腺原氨酸(T3)

增高见于甲状腺功能亢进症、高TBG血症。减低见于甲状腺功能减退症、低TBG血症。

游离三碘甲状腺原酸(FT3)

临床意义同T3,但较T3敏感且不受结合蛋白影响。

游离甲状腺素(FT4)

临床意义同T4,但较T4敏感不受结合蛋白影响。

甲状腺球蛋白(TG)

升髙见于甲状腺滤泡状癌、亚急性甲状腺炎、突眼性甲状腺肿、甲状腺功能进症、慢性淋细胞性甲状腺炎等。

甲状腺球蛋白抗体(anti-TG)

通常存在于有自身免疫性甲状腺疾病的病人体内,有助于诊断某些甲状腺紊乱,如Hashimoto 病、非中毒性甲状腺肿和Graves 病。大约在10% 的健康个体中可以检测到ThgAb。甲状腺球蛋白自身抗体可能对血清甲状腺球蛋白测定产生干扰作用。

甲状腺过氧化物酶抗体(anti-TPO-)

是检测自身免疫性甲状腺疾病的最为灵敏的测试方法,有助于诊断甲状腺自身免疫性紊乱和危险分层,帮助鉴别甲状腺自身免疫性紊乱与非自身免疫性甲状腺肿或甲状腺机能减退。

 
 

                          激  素

    项目

            主要临床意义

促卵泡激素(FSH)

增高见于原发性性腺功能减退症、卵巢或睾丸发育不全、绝经后等。减低见于腺垂体功能减退、不育等。

促黄体生成素(LH)

增增高见于卵巢切除、提早绝经、卵巢发育不全、初期睾丸衰退、曲细精管发育不全等。减低见于腺垂体功能减退、黄体功能不全、口服避孕药后。

雌二醇(E2)

升高见妊娠、多胎妊娠、卵巢癌、男性乳房发育等。减低见于卵巢功能不全、绝经期综合征、服用避孕药。

睾酮(T)

增高见于先天性肾上腺皮质增生、库欣综合、睾丸或卵巢肿瘤、女性多毛症等;减低见于腺垂体功能减退症、先天性睾丸发育不良、男性性功能障碍等。

孕酮(P)

增高见于先天性肾上腺皮质增生、库欣综合、葡萄胎等。减低见于流产、妊娠高血压综合征、无脑儿畸胎妊娠等。

泌乳素(PRL)

增高见于妊娠、哺乳、恶性肿瘤等。减低见于腺垂体功能减退症、单纯性PRL分泌缺乏症。

B-人绒毛膜促性腺激素(B -HCG)

用于诊断早孕及宫外孕,进行先兆性流产动态观察及判断预后,还可以作为孕期监护观察指标。此外,也可以用于绒癌 、恶性葡萄胎等辅助诊断及治疗后随访观察指标。

 

                      心肌标志物

    项目

              主要临床意义

肌红蛋白

血清Mb增高:见于急性心肌梗死早期、急性肌损伤、肌营养不良、肌萎缩、多发性肌炎、急性或慢性肾功能衰竭、严重充血性心力衰竭和 长期休克等。

肌酸激酶同工酶CK-MB

增增高见于卵巢切除、提早绝经、卵巢发育不全、初期睾丸衰退、曲细精管发育不全等。减低见于腺垂体功能减退、黄体功能不全、口服避孕药后。

肌钙蛋白I

cTnI是心肌损伤的特异指标。AMI发生后4-8h血清中的cTnI水平即可升高,12-14h达到峰值,6-10d恢复正常, cTnI的诊断特异性优于CK-MB和 Mb,可用评价不稳定心绞痛,cTnI水平升高预示有较高的短期死亡危险性,连续监测cTnI有助于判断血栓溶解和心肌再灌注。

肌钙蛋白T

增肌钙蛋白T是心肌损伤坏死的标志物,对急性心肌梗死的诊断和危险分层有重要的临床意义。肌钙蛋白T值升高提示心肌钙蛋白肌损伤,可见于急性心肌梗死、不稳定性心绞痛、肺梗死、心力衰竭及其他导致心肌损伤的疾病如胰腺炎、结缔组织疾病等,数值越高,损伤范围越广,在急性心肌梗死患者,3~6小时开始释放,10~24小时达到高峰,恢复正常时间cTnT和cTnI分别为l0~15天和5-9天;部分肾功能不全患者亦可出现升高。

N末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)

1.早期发现心力衰竭病人 

2.心衰患者的危险度分级

3.心源性猝死的预测 

4.心衰患者的治疗疗效监测及预后评估 

5.急性呼吸困难的鉴别诊断 

6.急性冠脉综合症的预后评估

7.心外科手术治疗术前、术中、术后的监测工具 1.

 

                      肝 纤 维 化

    项目

             主要临床意义

透明质酸(HA)

透明质酸主要由肝内皮细胞摄取分解,少量小分子亦由肾小球滤过。当肝,肾功能受损时,血清HA升高,且随病变加剧而呈升高趋势。血清HA检测能在一定程度上反映肝纤维化的发展与转归。

层粘连蛋白(LN)

层粘连蛋白也称为板层素。属结构性糖蛋白,存在于基底膜的透明层中。与肝纤维化形成有重要关系,是门脉高压发生的主要基础。血清LN水平常与Ⅳ型胶原、透明质酸等相平行,在肝纤维化诊断方面有重要价值。

Ⅲ型前胶原pcIII

Ⅲ型前胶原(pcⅢ)是Ⅲ型前胶原前体,血清PCⅢ含量与肝纤维化病变程度密切相关,反映出肝纤维合成情况。

Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)

Ⅳ型胶原(Ⅳ-C),血清Ⅳ-C被认为能很好地反映胶原的合成,与纤维化程度正相关。

 

 

                          炎  症

   项目

             主要临床意义

降钙素原(PCT)

降钙素原的临床意义①细菌感染与病毒感染的鉴别诊断②帮助SIRS/脓毒症的早期诊断,评估疾病的严重程度及预后③抗生素治疗效果的评估,指导临床抗生素使用④手术和严重创伤患者细菌感染并发症监测⑤胰腺炎鉴别诊断

白介素-6(IL-6)

IL-6在感染和损伤引起的炎症和免疫反应介导的过程中起着重要的作用,IL-6水平的升高与许多疾病相关,这些疾病包括自身免疫疾病、肾小球膜细胞增生性肾小球肾炎、牛皮癣和浆细胞瘤以及骨髓瘤等恶性病。

 

                        糖 代 谢

    项目

               主要临床意义

岛素(Insulin)

增高:胰岛素瘤, II 型糖尿病(NIDDM),自身免疫性胰岛素综合征(自身免疫性胰岛素受体抗体和胰岛素抗体综合征), 肝硬化, 甲状腺功能亢进,肢端肥大。营养不良型肌强直、胰腺增生导致的低血糖症;部分氨基酸、胰高血糖素、睾酮、生长激素及口服避孕药可使血中胰岛素增高。

减低:见于I型糖尿病,部分II型糖尿病,垂体功能低下症,肾上腺皮质功能低下,继发性胰腺损伤和慢性胰腺炎;儿茶酚胺、β受体阻滞剂及利尿剂可使胰岛素水平减低。

C肽(C-Peptide)

1测定C肽浓度,有助于糖尿病的临床分型、估计胰岛素治疗的效果都有一定的临床意义。(2)因为C肽不受胰岛抗体干扰,对接受胰岛素治疗的患者,可直接测定C肽浓度,以判断患者胰岛功能。

 

                         贫  血

  项目

             主要临床意义

铁蛋白(Ferritin)

铁蛋白的浓度与机体内的总铁含量成正比,不受日间变化影响,是一种检测早期铁缺乏的灵敏性方法。

增高:慢性炎症,急慢性肝脏疾病,慢性肾衰竭以及某些类型的肿瘤病中(如白血病、肺癌、乳腺癌)。亦是冠心病危险因素,饮酒后铁蛋白一过性增高。

维生素B12(VB12)

增高:急性白血病,淋巴瘤等恶性肿瘤。

降低:肝硬变,镰形红细胞性贫血,慢性髓性白血病,慢性骨髓性白血病转化期,肝硬变,酒精中毒,妊

叶酸 

(Folate) 

血清叶酸(Fol2)水平反映了最近叶酸的摄入量。红细胞 (RBC2)叶酸反映长期以来的叶酸储存状况。

增高:恶性贫血,再生障碍性贫血。

降低:叶酸缺乏,急性淋巴细胞白血病,急性骨髓性白血病,慢性骨髓性白血病转化期,肝硬变,酒精中毒,妊娠。

 
 

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